小鼠CD146分子(CD146)檢測試劑盒
簡介  
CD146是一種屬于免疫球蛋白超家族的結(jié)點粘附分子，sCD146 通過特異性與單核細胞結(jié)合，從而刺激跨內(nèi)皮的遷移，參與到炎癥，它也參與了血管生成，因此，sCD146對參與血管形成的不同細胞類型表現(xiàn)出趨化活性，如平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞，包括祖先內(nèi)皮細胞（EPC），此外，用sCD146處理EPC導(dǎo)致遷移、增殖和在 Matrigel中形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)的能力增加，表明sCD146在內(nèi)皮細胞上存在一個膜相關(guān)的結(jié)合伙伴。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物CD146，清洗后，再加入抗體標(biāo)記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中CD146的濃度。

操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當(dāng)使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{色。

5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。

注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處理后洗手。 

試劑準(zhǔn)備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先從800ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至40ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的40ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將40ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為:  40ng/mL、  20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、  2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL，從濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。

結(jié)果的計算

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

小鼠CD146分子(CD146)檢測試劑盒
示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計算樣本結(jié)果
靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.31ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別重組小鼠CD146。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

實驗步驟匯總 
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，37℃避光反應(yīng)1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物，37℃避光反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

小鼠CD146分子ELISA檢測試劑盒用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中小鼠的CD146使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，小鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。